29Nov

4 Tecnologías de POC para Diagnóstico

La Tecnología de Flujo Lateral o “lateral flow technology” en la bibliografía anglosajona, es el estadio más simple dentro del rango de inmunoensayos en fase sólida.

Exactamente son las tiras rápidas o en casete donde nuestra muestra de sangre u orina fluye en horizontal por pura capilaridad sobre un soporte de papel (nitrocelulosa), hasta reaccionar con un anticuerpo específico generando una reacción medible ópticamente. O bien desarrollando un color que simplemente se comprueba a la vista.

Resultado de imagen de lateral flow immunochromatographic

Diferentes tecnologías de POC

Estos test en su versión más sencilla, y con un resultado PASA/NO PASA, conforman la etapa más sencilla en los equipos que hoy analizamos:

1.  Equipos POC por Inmunocromatografía

Son lectores muy sencillos que emplean una química cromogénica, donde el equipo ilumina con 1 o 2 longitudes de onda la tira test, y en los que un detector lee habitualmente la reflexión de la luz del color que se ha desarrollado en la reacción. Sus prestaciones habituales son CV típicos aprox del 30% y sensibilidad de 100ng/ml. Miden densidades ópticas o “cantidad de color”.

Actualizaciones de esta tecnología que han mejorado sus prestaciones son, el empleo de un detector CMOS en vez de un CCD (un tipo de cámara), partículas de Oro Coloidal como sostén del anticuerpo para aumentar la sensibilidad; o bien pequeños algoritmos de software que miden área cromogénica en vez de color en un punto, con el fin de convertir la tecnología en cuantitativa (semi-cuantitativo).

2.  Equipos POC por FIA

Nomenclatura que procede de “Fluorescenceinmunoassay”. La gran diferencia es la sensibilidad. La fluorescencia es una técnica mucho más resolutiva porque la señal se multiplica por un factor no inferior a 1000 veces respecto al color medido en las técnicas cromogénicas. La capacidad de detección (sensibilidad) de nuestro analito de interés por ende también se multiplica por 1000. El anticuerpo que detecta nuestro analito está unido a un fluoróforo que al ser estimulado por luz UV emite luz en el rango visible (fluorescente) y esa señal se lee con un detector en el rango visible.

Se consiguen CV<20% y sensibilidades hasta 0.2/0.5 ng/ml. En general se considera un nivel de tecnología cuantitativa.

Algunos fabricantes han incorporado mejoras a determinadas tecnologías para incrementar ligeramente las prestaciones, tales como emplear un láser como fuente de iluminación, o bien soportes microfluidicos en lugar de simples cartuchos por capilaridad, para incrementar la efectividad de la reacción antígeno-anticuerpo.

3.   Equipos TRFIA o TRF

Si queremos cuantificar con una sensibilidad de una década másesto es, 0.02/0.08 de PCT o d-Dimero, y obtener CVs inferiores al 10% entonces hemos de emplear equipos TRF o incluso de la tecnología que comentamos en el apartado a continuación de éste que ahora tratamos.

TRF procede de las iniciales “Time Resolved Fluorescence.La detección de Fluorescencia en Tiempo Resuelto se basa en el empleo de fluoróforos de larga vida, conocidos como lantánidos, como Europio, Terbio, Samario y Disprosio. A diferencia de las medidas de intensidad de fluorescencia, en las que la emisión ocurre en nanosegundos después de la excitación, estos lantánidos, protegidos en unas nanoesferasmicelares emiten luz durante un periodo más largo (microsegundos). Esto ayuda a reducir el ruido de fondo mediante el retraso del comienzo de la medida hasta que la señal del ruido de fondo decae. Conviene explicar que el ruido de fondo o background es la  fluorescencia natural que también emiten tanto la muestra como  el soporte físico donde tiene lugar la reacción.

Otra ventaja de este método consiste en que hay un “gran desplazamiento de stock”; esto es, la longitud de onda a la que emiten fluorescencia las microesferas está mucho más separada de la longitud de onda de la luz incidente, con lo cual reducimos la posibilidad de lecturas incorrectas (poco crosstalk).

Aunque la técnica parezca más complicada el usuario emplea una metodología gemela al de un equipo de POC pero ganando mucha sensibilidad. La exactitud también se amplía y según modelos y condiciones puede llegar a 10-18mol/L. Los inconvenientes son un precio mayor, y en algunos casos una logística más complicada de los kits de ensayo, que han de ser transportados con refrigeración.

4.  Equipos UPT-LF o Luminiscencia de Up Conversion

Son escasos, pero se pueden encontrar equipos POC en el mercado que incorporan esta infrecuente tecnología, aplicada a la biomedicina y al análisis de alimentos. Se trata de la metodología “Up ConvertingPhosporInmunoassay”.

Contrariamente a la Fluorescencia, donde una luz de alta energía y baja longitud de onda excita a un anticuerpo marcado y produce luz de menor energía obteniendo mayor longitud de onda, en el fenómeno de UpConversion se ilumina la muestra con luz infrarroja, y el fluoróforo emite una luz visible, de mayor energía, y menor longitud de onda. Por esa razón  también se le ha dado en llamar Luminiscencia Anti-Stokes.

analizador-POC
 ANALIZADOR DE INMUNOFLUORESCENCIA POC FA160

De nuevo, empleamos micropartículas cerámicas o magnéticas, dopadas con lantánidos para conseguir esta transferencia de energía.

Las ventajas son dos y muy claras. Debido a que el fenómeno de la UpConversion no ocurre de manera espontánea en la naturaleza, el efecto ruido o background de la propia muestra o el soporte es literalmente cero. La segunda gran ventaja consiste en que nuestra muestra dopada con este marcador tan particular emite luz de alta energía, con lo cual incrementamos la sensibilidad.

Las pequeñas desventajas coinciden con las del método TRF previamente explicado.

En general hoy en día la inmensa mayoría de los instrumentos POC para proteínas, tales como los que cuantifican marcadores cardíacos o procalcitonina se basan en la metodología FIA. Resulta ser la más flexible para los fabricantes, y el promedio de usuario en el contexto del “Point of Care” no parece pedirle más sensibilidad o exactitud a sus medidas. Akralab dispone del modelo FA-160 de la marca Lifotronic, un equipo compacto de FIA dotado de 6 canales de incubación.

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