27Nov

Fuentes de error habitual en qPCR para detección de COVID

La incorporación de la técnica de PCR en laboratorios de diagnóstico clínico está suponiendo un esfuerzo por parte de usuarios y proveedores, especialmente dirigido a garantizar el correcto funcionamiento de un proceso para confirmar que no se cometen errores. Hablamos de las diferentes fases para asegurar una prueba exitosa.

La estandarización de la qPCR o PCR cuantitativa como método de detección de infección por COVID-19 ha traído novedades a laboratorios clínicos, en los que la biología molecular no había estado tan presente hasta ahora.

El uso de técnicas de biología molecular requiere de manos entrenadas y precauciones específicas. Los microvolúmenes que se utilizan en estas reacciones pueden resultar difíciles de controlar en manos inexpertas. La contaminación y/o degradación de los reactivos puede llevar a diagnósticos erróneos; muchas veces, la interpretación de los resultados requiere  de experiencia previa con patrones de amplificación de qPCR. En este contexto, la incorporación de esta técnica en laboratorios de diagnóstico clínico está suponiendo un esfuerzo por parte de usuarios y proveedores. Un esfuerzo dirigido a garantizar el correcto funcionamiento de un proceso que, de manera inherente a la curva de aprendizaje, suele pasar por varios episodios de ensayo-error-resolución.

En general, y a grandes rasgos, podríamos dividir el proceso de detección de COVID en tres fases principales: (I) fase preanalítica, en la que se lleva a cabo la recolección y almacenamiento de la muestra; (II) fase de procesado de la muestra, que contempla etapas de extracción de ácidos nucleicos o, alternativamente, lisis de las membranas víricas para PCR directa y retrotranscripción; (III) fase de detección, en la que se produce la amplificación de las moléculas de ADNc y la detección del aumento de los niveles de fluorescencia; (IV) fase de diagnóstico, en la que se lleva a cabo el diagnóstico en función del patrón de amplificación de los genes analizados. Cada una de estas fases contempla una serie de errores relativamente habituales, que se exponen a continuación y que podrían servir para, una vez identificados, optimizar el proceso de detección en general:

 

(I) Fase preanalítica:

 

  • Recolección insatisfactoria de la muestra: El frotis nasofaríngeo no es lo suficientemente intenso, no se produce gran recolección de material genético. Se recomienda frotis nasofaríngeo a través de ambos orificios nasales. Necesita producir cierto discomfort en el paciente.
  • Degradación parcial de la muestra desde su recolección: Posible degradación de la muestra si no se almacena correctamente. El ARN es mucho más inestable que el ADN. Se recomienda almacenar en frigorífico dentro de las primeras 24h. En congelador para más de 24h. En congelador especial de -60/-80ºC para periodos de más de 72h.

 

(II) Fase de procesado de la muestra:

 

  • Extracción de ARN insatisfactoria: Pérdida del ARN durante el proceso de extracción. Puede producirse por defectos o perforaciones accidentales en las membranas, si se utilizan kits basado en minicolumnas cromatográficas. Con métodos basados en bolas magnéticas una de las principales fuentes de error es una centrifugación o incubación en gradilla magnética insuficiente; esto conduce a una pérdida parcial del material genético y a ARN contaminado de poca calidad.
  • Lisis insatisfactoria: Para PCR directa, en la que no se lleva a cabo extracción de ARN propiamente dicha, defectos en la composición del buffer de lisis podrían provocar una lisis insatisfactoria. Además, si el buffer no se ha atemperado a temperatura ambiente correctamente, la reacción de lisis ocurriría a temperaturas más frías que las deseadas. Para la lisis de membranas la temperatura de reacción es muy importante.

 

qPCR COVID

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(III) Fase de detección:

 

  • Amplificación del ADNc insatisfactoria: Los ciclos de congelación-descongelación son cruciales para evitar problemas en esta fase. Es necesario atemperar los reactivos de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Por lo general, los kits de detección no necesitan conservarse en hielo mientras se monta la reacción de PCR pero sí que necesitan otra serie de precauciones. La descongelación de los reactivos debe ser a temperatura ambiente, evitando aportar calor de manera directa (manos). Además, en estos casos en particular es especialmente importante descongelar los reactivos evitando la exposición a fuentes de luz. Recordemos que la qPCR para detección de COVID se basa en sondas fluorescentes, basadas en la tecnología Taqman®. La incidencia de luz sobre estas sondas puede provocar la pérdida de su capacidad de excitación-emisión.

Adicionalmente, es importante vortexear o invertir los tubos de reactivos varias veces tras su descongelación para homogenizar la distribución de sus solutos; de esta forma, evitamos que se precipiten ocasionalmente o distribuirse en la disolución de manera irregular. Cambios en las concentraciones reales de cofactores como el MgCl2 pueden ser determinantes para la actividad de la polimerasa.

  • Para PCR directa cobran especial importancia en este apartado los medios de transporte de virus o MTVs. Es importante que no tenga inhibidores como el cloruro de guanidinio; también hay que evitar un contenido en sales solubles demasiado alto, generalmente visible en función de la coloración. Existen algunas casas comerciales, como Biocomma, cuyo MTV “clásico” ha presentado problemas de inhibición en la reacción de PCR, impidiendo la amplificación del control interno. Otros MTVs, como el de Kaibili (Genesis), permiten el correcto funcionamiento de la reacción de PCR.

 

(IV) Fase de diagnóstico:

 

  • Uno de los problemas más comunes han sido usuarios que confunden una reacción inhibida, donde no hay amplificación de genes víricos ni del control interno, con una reacción satisfactoria; esta última es negativa para COVID, no hay amplificación de genes víricos pero sí del control interno. Estos casos suelen estar relacionados con falta de experiencia en la interpretación de gráficas de amplificación de qPCR; estos problemas suelen solucionarse con una pequeña formación que suelen llevar a cabo los especialistas de producto del propio proveedor.
  • La cuantificación de la carga viral es un proceso que está generando controversia últimamente debido al poco consenso que existe entre los laboratorios involucrados. Por lo general entendemos que las comparaciones de Ct’s absolutos de genes víricos no es totalmente correcta; también asumimos que la relativización respecto a un estándar interno es conveniente, con el objetivo de normalizar la concentración de ARN de partida entre muestras. No obstante, esta homogenización en los criterios de cuantificación todavía no se ha llevado a cabo por fuentes oficiales.

 

Como se puede observar, las fuentes de error son muchas y variadas y, bien de manera individual, o como una combinación de ellas, pueden provocar fallos constantes en las reacciones de PCR. La optimización de estos factores contribuirá al mejor funcionamiento de la plataforma de detección de COVID.

Escrito por: Sergio Ibáñez, nuestro Especialista en Biología Molecular.

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